引用本文： 施绍瑞, 聂滨, 郭渝, 罗立, 张林琳, 李文全, 鲜龚兵, 吴家亮, 林春兴, 陈心足. 新型冠状病毒肺炎病例多种生物样本的病毒核酸检测结果. 华西医学, 2020, 35(2): 132-136. doi: 10.7507/1002-0179.202002063 复制
新型冠状病毒肺炎（novel coronavirus pneumonia，NCP）最初发生在湖北武汉，初步考虑与野生动物接触感染相关，目前已明确可以人传人[1-2]。2019 新型冠状病毒（2019 novel coronavirus，2019-nCoV）属于冠状病毒科 β 属，其基因特征与严重急性呼吸综合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）相关的冠状病毒和中东呼吸综合征相关冠状病毒有明显区别。目前研究显示 2019-nCoV 与蝙蝠 SARS 样冠状病毒（bat-SL-CoVZC45）同源性为 85% 以上[3-4]。体外分离培养时，2019-nCoV 在 96 h 左右即可在人呼吸道上皮细胞内发现。NCP 临床表现以干咳、发热为主，但也可隐匿发病[5]，确诊主要依靠实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR）和病毒基因测序。RT-PCR 可以检测各种样本中的 2019-nCoV RNA，其应用简便，在 NCP 的诊断和治愈评估中具有重要意义。《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第五版）》将 2019-nCoV 核酸 RT-PCR 确诊检测的生物样本界定为呼吸道标本或血液标本[6]，但目前对其他类型的生物样本的 2019-nCoV 核酸检测结果缺少报道。本研究拟利用实时荧光定量 RT-PCR 方法检测 NCP 患者不同类型生物样本的带毒情况，初步阐述 2019-nCoV 在患者体内不同系统的分布特点及其临床意义，为 2019-nCoV 的早期诊断和传播途径分析提供实验室依据。
1 资料与方法
1.1 研究对象
本研究设计为小样本横断面观察性研究。本医院（宜宾市第二人民医院·四川大学华西医院宜宾医院）为 NCP 定点收治医院，于 2020 年 1 月 24 日接诊首例 NCP[7]。本研究纳入接诊首例以来至 2020 年 2 月 2 日本医院收治的所有 NCP 确诊病例。NCP 诊断标准：依据《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第三版）》和《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第四版）》，符合相关流行病学、临床表现，以及咽拭子/痰液/纤维支气管镜灌洗液检测 2019-nCoV 核酸阳性[4-5]。本研究经宜宾市第二人民医院·四川大学华西医院宜宾医院生物医学伦理委员会审核，经应急流程获得批准立项（批件号：2020-027-01）。所有纳入病例的个人信息均作匿名化处理。所有纳入本研究的病例均被告知所采集的生物样本仅用于科学研究和疫情防控，个人生物遗传学信息不会泄露。所有观察对象本人均签署了研究知情同意书。所有研究知情同意书纸质文本均密封暂存于隔离病房内。
1.2 生物样本采集
本研究中确诊时呼吸道标本 2019-nCoV 核酸检测结果为回顾性收集的基线。2020 年 2 月 2 日主管医生在三级防护条件下，在隔离病房采集 NCP 患者的咽拭子、血液、粪便、尿液样本作为复查。所有生物样本均严格按标准流程密封转运至本院检验科。
1.3 试剂和仪器
病毒 RNA 提取试剂盒、荧光定量 RT-PCR 试剂均为湖南圣湘生物科技股份有限公司提供。采用美国安捷伦科技公司 Mxp3000 PCR 仪进行实时荧光定量 PCR 扩增。
1.4 引物与荧光探针
引物与荧光探针均由湖南圣湘生物科技股份有限公司提供，有 2 个靶序列。FAM（ORF-1ab）区域靶标（ORF1ab）：正向引物为 CCCTGTGGGTTTTACACTTAA；反向引物为 ACGATTGTGCATCAGCTGA；荧光探针为 5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'。ROX（N 基因）区域：正向引物为 GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT；反向引物为 CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG；荧光探针为 5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3'。
1.5 样本预处理与检测
1.5.1 样本预处理
所有样本先经过 56℃ 30 min 灭活。
血清样本（Tris-EDTA 缓冲液/生理盐水基质）：取出样本后混匀，加入 10 μL 待测样品和 10 μL 样本核酸释放剂到 PCR 扩增管中，枪头吹打 3～5 次，作为待测样本备用。
咽拭子/痰液/纤维支气管镜灌洗液样本（病毒保存液等其他基质）：取出样本后混匀，取 100～200 μL 待测样本于 1.5 mL 离心管中，以离心半径 8 cm、转速 12 000 r/min 离心 10 min，弃上清液后往沉淀中加入 50 μL 样本核酸释放剂震荡混匀，静置 10 min，作为待测样本备用。
尿液标本：混匀样本，取 500 μL 样本置 1.5 mL 离心管中，以离心半径 8 cm、转速 12 000 r/min 离心 5 min 后弃上清液，沉淀加入 1 mL 生理盐水混匀重悬，以离心半径 8 cm、转速 12 000 r/min 离心 5 min 弃上清液，沉淀加入 50 μL 核酸释放剂裂解 10 min。
粪便标本：取黄豆般大小的大便置于 1.5 mL 离心管中，加入 1 mL 生理盐水振荡混匀 10 s，以离心半径 8 cm、转速 3 000 r/min 离心 30 s，取 200 μL 上清液置于新的离心管中，以离心半径 8 cm、转速 12 000 r/min，离心 5 min，弃上清液，加入 1 mL 生理盐水混匀重悬，以离心半径 8 cm、转速 12 000 r/min 离心 10 min，沉淀加入 50 μL 核酸释放剂，静置 10 min。
1.5.2 样本检测
依次加入 30 μL 配制好的 PCR 混合液和 20 μL 上述处理后样本至 PCR 反应管，在实时荧光 PCR 仪上机进行荧光定量 PCR 扩增检测。所有检查均重复 2 次，若至少其中 1 次为阳性即判定为 2019-nCoV 核酸检测阳性。
1.6 结果评价
先分析内标在 HEX 通道是否有扩增曲线，且扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时所对应的扩增循环数（cycle threshold，Ct）≤40。① 若有，则表示本次检测有效，可继续进行后续分析：A. 若 FAM 或 ROX 通道检测到典型的 S 型扩增曲线，且 Ct≤40，则判定该结果为 2019-nCoV 核酸检测为阳性；B. 若 FAM 及 ROX 通道均未检测到典型的 S 型扩增曲线（未检测到 Ct），或 Ct>40，则表示 2019-nCoV 核酸检测为阴性。② 若内标在 HEX 通道没有检测到 Ct 或 Ct>40，则表示本次检测样本浓度太低或者有干扰物质抑制反应，需重新实验。
1.7 统计学方法
本研究为小样本观察性研究，描述性报道事件计数，无假设检验。
2 结果
2.1 病例信息
本研究共纳入观察了 7 例确诊 NCP 病例，均为输入型病例，其中男 5 例，女 2 例；平均年龄（31.9±9.1）岁；所有病例均以发热为首发症状，伴或不伴呼吸道症状。依据《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第四版）》，7 例均经院内救治专家组会诊评估分型为普通型。经积极治疗无向重型/危重型转化的病例。见表 1。
表1
7 例患者的基本情况
2.2 检测结果
本研究检测不同生物样本类型的 2019-nCoV 核酸共 41 份（表 2），2 套引物均能较好地扩增出部分标本 2019-nCoV 基因的特异性片段。
表2
不同类型生物样本的 2019-nCoV 核酸检测结果
2.2.1 确诊时检测情况
7 例患者在发热后第 3～7 天经咽拭子/痰液/纤维支气管镜灌洗液标本 2019-nCoV 核酸检测阳性确诊，其中 2 例在发热后第 3 天确诊（图 1）；确诊时，咽拭子单阳 2 例，痰液单阳 2 例，咽拭子和痰液阳性 2 例，咽拭子和纤维支气管镜灌洗液标本阳性 1 例。
图1
咽拭子 2019-nCoV 核酸检测结果的时间分布图
2.2.2 复查时检测情况
2020 年 2 月 2 日对在院的 7 例患者统一进行复查，时间分别处于各患者发热后的第 7～15 天。经治复查 2019-nCoV 核酸结果显示，5 例患者咽拭子 2019-nCoV 核酸检测阴性，其中 1 例处于发热后第 7 天（图 1）；7 例患者血液、粪便、尿液中均未检测出 2019-nCoV 核酸（表 2）。
3 讨论
本项小样本横断面观察性研究共纳入 7 例输入型普通型 NCP 患者，其确诊时间在发热后第 3～7 天。本研究中经治复查时间分别处于各患者发热后的第 7～15 天，2019-nCoV 核酸结果显示，5 例患者咽拭子检测阴性，其中 1 例在发热后第 7 天检测 2019-nCoV 核酸即转阴；7 例患者血液、粪便、尿液中均未检测出 2019-nCoV 核酸。
目前，检测 2019-nCoV 有多种方法。病原学检测方法（即通过体外培养分离病毒）费时较长，分离阳性率不高。血清学方法需等待患者出现特异性抗体，难以对病毒感染进行早期诊断。实时荧光 RT-PCR 技术可明显提高 2019-nCoV 检测的特异性和敏感性。该法可用于检测各类型生物样本（血液、痰液、呼吸道分泌物、粪便和尿液等）中 2019-nCoV 的 RNA。《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第五版）》提出呼吸道标本或血液标本通过实时荧光 RT-PCR 检测 2019-nCoV 核酸阳性是确诊的方法之一，解除隔离出院的实验室标准为间隔至少 1 d 的连续 2 次呼吸道标本 2019-nCoV 核酸检测阴性[6]。因此，采用实时荧光 RT-PCR 检测技术在 2019-nCoV 的早期诊断和救治效果评价中具有重要临床意义。
2020 年 1 月 24 日，根据疫情防控需要，四川省依法依规及时启动重大突发公共卫生事件一级响应，全省网格化排查入川人员，以及早期全面部署预检分诊、发热门诊和定点收治医院。因此，这一系列强有力的防控措施实现了输入型 NCP 病例“早发现、早报告、早隔离、早治疗”的落实。本研究提示实时荧光 RT-PCR 检测在技术上可实现输入型普通型 NCP 病例的早期检出。有未发表数据提示有在发病后第 1 天即检出 2019-nCoV 核酸的病例。输入型 NCP 病例的重型/危重型的比例在国内普遍较低，与在严防严控的情况下实现了早诊断和早治疗有一定关系。也因为实现了早诊断和早治疗，本研究观察病例均无向重型/危重型转化的倾向，而且 1 例早在发热后第 7 天即 2019-nCoV 核酸检测转阴，转归良好。
本研究对同一患者同一时间不同种类生物样本的 2019-nCoV 核酸进行了检测，以观察 2019-nCoV 在呼吸道、循环系统、消化道、泌尿道的分布情况。普通型 NCP 患者随着机体免疫系统的较快激活和增强，体内病毒被清除或抑制在低水平，因此有的病例也呈现 2019-nCoV 核酸检测早期转为阴性。除呼吸道标本外，NCP 病例的其他生物样本行 2019-nCoV 核酸检测少有报告。本研究在普通型 NCP 病例血液标本中未检出 2019-nCoV 核酸，逆向推测若血液中检出 2019-nCoV 核酸是否为重型/危重型的预测指标需要进一步的研究探索。此外，本研究在普通型 NCP 病例粪便和尿液标本中未检出 2019-nCoV 核酸，2019-nCoV 是否侵入普通型 NCP 病例的消化道和泌尿道需要更进一步的研究，普通型 NCP 病例是否成为粪口传播的传染源亦需要进一步的研究。但有新闻媒体报道 NCP 病例粪便中可检出 2019-nCoV 核酸，因此为探究 2019-nCoV 的传播途径，四川省卫生健康委员会于 2020 年 2 月 6 日启动了全省定点收治医院开展 NCP 病例的粪便 2019-nCoV 核酸检测项目。此项政府主导的多中心研究有助于阐明 2019-nCoV 是否经粪口途径传播。
本研究仅为初步探索性分析，因此存在一些不足之处：① 纳入病例数很少，因此若分别开展湖北内和湖北外的多中心研究，则能得到更为确定性的研究结果；② 缺少重型/危重型病例，因此同样建议在湖北内和湖北外纳入重型/危重型进行此类多类型生物样本的检测分析；③ 观察时间点不统一，本研究为单日的横断面研究设计，因此病例分别处于病程中不同时间点，异质性较大；④ 缺少连续观察，病例追踪时间短，若采用前瞻性队列研究设计动态观察早期、中期、远期同一时间点 2019-nCoV 核酸检测结果则更具有分析价值，尤其是病程初期和后期的血液、粪便、尿液标本检测目前缺少相关探索性研究；⑤ 本研究复查咽拭子 2019-nCoV 核酸阴性者达 5 例，因而其同一时点血液、粪便、尿液检测阴性的可分析价值相对较为有限，建议纳入更多咽拭子 2019-nCoV 核酸阳性的病例同期检测其多种生物样本的 2019-nCoV 核酸；⑥ 最后，目前检测手段尚需继续完善，以减少假阴性结果导致的分析和判断受影响。
综上所述，本项纳入普通型 NCP 病例的小样本横断面观察性研究发现，对于普通型 NCP 病例，实时荧光 RT-PCR 检测在技术上可在发病后第 3～7 天检出 2019-nCoV 核酸，同时 2019-nCoV 核酸可在病程第 7 天开始转阴。普通型 NCP 病例在病程第 7～15 天期间的单日血液、粪便、尿液中未检出 2019-nCoV 核酸。本研究仅为初步的探索性研究，尚需要更高质量的研究来获得更为确定性的结论。
志谢：衷心感谢国内外的社会各界对新型冠状病毒肺炎疫情阻击战作出的巨大努力和支持。向奋战在疫情前线守卫人民生命安全和身体健康的所有医务工作者致敬。
利益冲突：所有作者无申报事项。
新型冠状病毒肺炎（novel coronavirus pneumonia，NCP）最初发生在湖北武汉，初步考虑与野生动物接触感染相关，目前已明确可以人传人[1-2]。2019 新型冠状病毒（2019 novel coronavirus，2019-nCoV）属于冠状病毒科 β 属，其基因特征与严重急性呼吸综合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）相关的冠状病毒和中东呼吸综合征相关冠状病毒有明显区别。目前研究显示 2019-nCoV 与蝙蝠 SARS 样冠状病毒（bat-SL-CoVZC45）同源性为 85% 以上[3-4]。体外分离培养时，2019-nCoV 在 96 h 左右即可在人呼吸道上皮细胞内发现。NCP 临床表现以干咳、发热为主，但也可隐匿发病[5]，确诊主要依靠实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR）和病毒基因测序。RT-PCR 可以检测各种样本中的 2019-nCoV RNA，其应用简便，在 NCP 的诊断和治愈评估中具有重要意义。《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第五版）》将 2019-nCoV 核酸 RT-PCR 确诊检测的生物样本界定为呼吸道标本或血液标本[6]，但目前对其他类型的生物样本的 2019-nCoV 核酸检测结果缺少报道。本研究拟利用实时荧光定量 RT-PCR 方法检测 NCP 患者不同类型生物样本的带毒情况，初步阐述 2019-nCoV 在患者体内不同系统的分布特点及其临床意义，为 2019-nCoV 的早期诊断和传播途径分析提供实验室依据。
1 资料与方法
1.1 研究对象
本研究设计为小样本横断面观察性研究。本医院（宜宾市第二人民医院·四川大学华西医院宜宾医院）为 NCP 定点收治医院，于 2020 年 1 月 24 日接诊首例 NCP[7]。本研究纳入接诊首例以来至 2020 年 2 月 2 日本医院收治的所有 NCP 确诊病例。NCP 诊断标准：依据《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第三版）》和《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第四版）》，符合相关流行病学、临床表现，以及咽拭子/痰液/纤维支气管镜灌洗液检测 2019-nCoV 核酸阳性[4-5]。本研究经宜宾市第二人民医院·四川大学华西医院宜宾医院生物医学伦理委员会审核，经应急流程获得批准立项（批件号：2020-027-01）。所有纳入病例的个人信息均作匿名化处理。所有纳入本研究的病例均被告知所采集的生物样本仅用于科学研究和疫情防控，个人生物遗传学信息不会泄露。所有观察对象本人均签署了研究知情同意书。所有研究知情同意书纸质文本均密封暂存于隔离病房内。
1.2 生物样本采集
本研究中确诊时呼吸道标本 2019-nCoV 核酸检测结果为回顾性收集的基线。2020 年 2 月 2 日主管医生在三级防护条件下，在隔离病房采集 NCP 患者的咽拭子、血液、粪便、尿液样本作为复查。所有生物样本均严格按标准流程密封转运至本院检验科。
1.3 试剂和仪器
病毒 RNA 提取试剂盒、荧光定量 RT-PCR 试剂均为湖南圣湘生物科技股份有限公司提供。采用美国安捷伦科技公司 Mxp3000 PCR 仪进行实时荧光定量 PCR 扩增。
1.4 引物与荧光探针
引物与荧光探针均由湖南圣湘生物科技股份有限公司提供，有 2 个靶序列。FAM（ORF-1ab）区域靶标（ORF1ab）：正向引物为 CCCTGTGGGTTTTACACTTAA；反向引物为 ACGATTGTGCATCAGCTGA；荧光探针为 5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'。ROX（N 基因）区域：正向引物为 GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT；反向引物为 CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG；荧光探针为 5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3'。
1.5 样本预处理与检测
1.5.1 样本预处理
所有样本先经过 56℃ 30 min 灭活。
血清样本（Tris-EDTA 缓冲液/生理盐水基质）：取出样本后混匀，加入 10 μL 待测样品和 10 μL 样本核酸释放剂到 PCR 扩增管中，枪头吹打 3～5 次，作为待测样本备用。
咽拭子/痰液/纤维支气管镜灌洗液样本（病毒保存液等其他基质）：取出样本后混匀，取 100～200 μL 待测样本于 1.5 mL 离心管中，以离心半径 8 cm、转速 12 000 r/min 离心 10 min，弃上清液后往沉淀中加入 50 μL 样本核酸释放剂震荡混匀，静置 10 min，作为待测样本备用。
尿液标本：混匀样本，取 500 μL 样本置 1.5 mL 离心管中，以离心半径 8 cm、转速 12 000 r/min 离心 5 min 后弃上清液，沉淀加入 1 mL 生理盐水混匀重悬，以离心半径 8 cm、转速 12 000 r/min 离心 5 min 弃上清液，沉淀加入 50 μL 核酸释放剂裂解 10 min。
粪便标本：取黄豆般大小的大便置于 1.5 mL 离心管中，加入 1 mL 生理盐水振荡混匀 10 s，以离心半径 8 cm、转速 3 000 r/min 离心 30 s，取 200 μL 上清液置于新的离心管中，以离心半径 8 cm、转速 12 000 r/min，离心 5 min，弃上清液，加入 1 mL 生理盐水混匀重悬，以离心半径 8 cm、转速 12 000 r/min 离心 10 min，沉淀加入 50 μL 核酸释放剂，静置 10 min。
1.5.2 样本检测
依次加入 30 μL 配制好的 PCR 混合液和 20 μL 上述处理后样本至 PCR 反应管，在实时荧光 PCR 仪上机进行荧光定量 PCR 扩增检测。所有检查均重复 2 次，若至少其中 1 次为阳性即判定为 2019-nCoV 核酸检测阳性。
1.6 结果评价
先分析内标在 HEX 通道是否有扩增曲线，且扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时所对应的扩增循环数（cycle threshold，Ct）≤40。① 若有，则表示本次检测有效，可继续进行后续分析：A. 若 FAM 或 ROX 通道检测到典型的 S 型扩增曲线，且 Ct≤40，则判定该结果为 2019-nCoV 核酸检测为阳性；B. 若 FAM 及 ROX 通道均未检测到典型的 S 型扩增曲线（未检测到 Ct），或 Ct>40，则表示 2019-nCoV 核酸检测为阴性。② 若内标在 HEX 通道没有检测到 Ct 或 Ct>40，则表示本次检测样本浓度太低或者有干扰物质抑制反应，需重新实验。
1.7 统计学方法
本研究为小样本观察性研究，描述性报道事件计数，无假设检验。
2 结果
2.1 病例信息
本研究共纳入观察了 7 例确诊 NCP 病例，均为输入型病例，其中男 5 例，女 2 例；平均年龄（31.9±9.1）岁；所有病例均以发热为首发症状，伴或不伴呼吸道症状。依据《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第四版）》，7 例均经院内救治专家组会诊评估分型为普通型。经积极治疗无向重型/危重型转化的病例。见表 1。
表1
7 例患者的基本情况
2.2 检测结果
本研究检测不同生物样本类型的 2019-nCoV 核酸共 41 份（表 2），2 套引物均能较好地扩增出部分标本 2019-nCoV 基因的特异性片段。
表2
不同类型生物样本的 2019-nCoV 核酸检测结果
2.2.1 确诊时检测情况
7 例患者在发热后第 3～7 天经咽拭子/痰液/纤维支气管镜灌洗液标本 2019-nCoV 核酸检测阳性确诊，其中 2 例在发热后第 3 天确诊（图 1）；确诊时，咽拭子单阳 2 例，痰液单阳 2 例，咽拭子和痰液阳性 2 例，咽拭子和纤维支气管镜灌洗液标本阳性 1 例。
图1
咽拭子 2019-nCoV 核酸检测结果的时间分布图
2.2.2 复查时检测情况
2020 年 2 月 2 日对在院的 7 例患者统一进行复查，时间分别处于各患者发热后的第 7～15 天。经治复查 2019-nCoV 核酸结果显示，5 例患者咽拭子 2019-nCoV 核酸检测阴性，其中 1 例处于发热后第 7 天（图 1）；7 例患者血液、粪便、尿液中均未检测出 2019-nCoV 核酸（表 2）。
3 讨论
本项小样本横断面观察性研究共纳入 7 例输入型普通型 NCP 患者，其确诊时间在发热后第 3～7 天。本研究中经治复查时间分别处于各患者发热后的第 7～15 天，2019-nCoV 核酸结果显示，5 例患者咽拭子检测阴性，其中 1 例在发热后第 7 天检测 2019-nCoV 核酸即转阴；7 例患者血液、粪便、尿液中均未检测出 2019-nCoV 核酸。
目前，检测 2019-nCoV 有多种方法。病原学检测方法（即通过体外培养分离病毒）费时较长，分离阳性率不高。血清学方法需等待患者出现特异性抗体，难以对病毒感染进行早期诊断。实时荧光 RT-PCR 技术可明显提高 2019-nCoV 检测的特异性和敏感性。该法可用于检测各类型生物样本（血液、痰液、呼吸道分泌物、粪便和尿液等）中 2019-nCoV 的 RNA。《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第五版）》提出呼吸道标本或血液标本通过实时荧光 RT-PCR 检测 2019-nCoV 核酸阳性是确诊的方法之一，解除隔离出院的实验室标准为间隔至少 1 d 的连续 2 次呼吸道标本 2019-nCoV 核酸检测阴性[6]。因此，采用实时荧光 RT-PCR 检测技术在 2019-nCoV 的早期诊断和救治效果评价中具有重要临床意义。
2020 年 1 月 24 日，根据疫情防控需要，四川省依法依规及时启动重大突发公共卫生事件一级响应，全省网格化排查入川人员，以及早期全面部署预检分诊、发热门诊和定点收治医院。因此，这一系列强有力的防控措施实现了输入型 NCP 病例“早发现、早报告、早隔离、早治疗”的落实。本研究提示实时荧光 RT-PCR 检测在技术上可实现输入型普通型 NCP 病例的早期检出。有未发表数据提示有在发病后第 1 天即检出 2019-nCoV 核酸的病例。输入型 NCP 病例的重型/危重型的比例在国内普遍较低，与在严防严控的情况下实现了早诊断和早治疗有一定关系。也因为实现了早诊断和早治疗，本研究观察病例均无向重型/危重型转化的倾向，而且 1 例早在发热后第 7 天即 2019-nCoV 核酸检测转阴，转归良好。
本研究对同一患者同一时间不同种类生物样本的 2019-nCoV 核酸进行了检测，以观察 2019-nCoV 在呼吸道、循环系统、消化道、泌尿道的分布情况。普通型 NCP 患者随着机体免疫系统的较快激活和增强，体内病毒被清除或抑制在低水平，因此有的病例也呈现 2019-nCoV 核酸检测早期转为阴性。除呼吸道标本外，NCP 病例的其他生物样本行 2019-nCoV 核酸检测少有报告。本研究在普通型 NCP 病例血液标本中未检出 2019-nCoV 核酸，逆向推测若血液中检出 2019-nCoV 核酸是否为重型/危重型的预测指标需要进一步的研究探索。此外，本研究在普通型 NCP 病例粪便和尿液标本中未检出 2019-nCoV 核酸，2019-nCoV 是否侵入普通型 NCP 病例的消化道和泌尿道需要更进一步的研究，普通型 NCP 病例是否成为粪口传播的传染源亦需要进一步的研究。但有新闻媒体报道 NCP 病例粪便中可检出 2019-nCoV 核酸，因此为探究 2019-nCoV 的传播途径，四川省卫生健康委员会于 2020 年 2 月 6 日启动了全省定点收治医院开展 NCP 病例的粪便 2019-nCoV 核酸检测项目。此项政府主导的多中心研究有助于阐明 2019-nCoV 是否经粪口途径传播。
本研究仅为初步探索性分析，因此存在一些不足之处：① 纳入病例数很少，因此若分别开展湖北内和湖北外的多中心研究，则能得到更为确定性的研究结果；② 缺少重型/危重型病例，因此同样建议在湖北内和湖北外纳入重型/危重型进行此类多类型生物样本的检测分析；③ 观察时间点不统一，本研究为单日的横断面研究设计，因此病例分别处于病程中不同时间点，异质性较大；④ 缺少连续观察，病例追踪时间短，若采用前瞻性队列研究设计动态观察早期、中期、远期同一时间点 2019-nCoV 核酸检测结果则更具有分析价值，尤其是病程初期和后期的血液、粪便、尿液标本检测目前缺少相关探索性研究；⑤ 本研究复查咽拭子 2019-nCoV 核酸阴性者达 5 例，因而其同一时点血液、粪便、尿液检测阴性的可分析价值相对较为有限，建议纳入更多咽拭子 2019-nCoV 核酸阳性的病例同期检测其多种生物样本的 2019-nCoV 核酸；⑥ 最后，目前检测手段尚需继续完善，以减少假阴性结果导致的分析和判断受影响。
综上所述，本项纳入普通型 NCP 病例的小样本横断面观察性研究发现，对于普通型 NCP 病例，实时荧光 RT-PCR 检测在技术上可在发病后第 3～7 天检出 2019-nCoV 核酸，同时 2019-nCoV 核酸可在病程第 7 天开始转阴。普通型 NCP 病例在病程第 7～15 天期间的单日血液、粪便、尿液中未检出 2019-nCoV 核酸。本研究仅为初步的探索性研究，尚需要更高质量的研究来获得更为确定性的结论。
志谢：衷心感谢国内外的社会各界对新型冠状病毒肺炎疫情阻击战作出的巨大努力和支持。向奋战在疫情前线守卫人民生命安全和身体健康的所有医务工作者致敬。
利益冲突：所有作者无申报事项。
