新型冠状病毒肺炎暴发以来，医院实验室成为检测疑似或确诊患者各类标本的重要场所。确诊患者的临床标本中可能存在高载量的 2019 新型冠状病毒，生物安全风险较高，故对医院实验室检测流程提出挑战。该文比较了临床微生物传统检测流程和全自动微生物流水线的微生物前处理、培养、鉴定及药敏分析，对病原微生物传统手工检测流程在此次疫情下存在的生物安全风险进行阐述，同时探讨了全自动微生物流水线在疫情中的生物安全保障作用及困境，旨在为未来全自动微生物流水线的推广提供一定依据。
引用本文： 黄学东, 肖玉玲, 李冬冬, 谢轶. 新型冠状病毒肺炎疫情下应用全自动微生物流水线的思考. 华西医学, 2020, 35(8): 901-904. doi: 10.7507/1002-0179.202006033 复制
此次新型冠状病毒肺炎疫情暴发后，除病毒检测工作外，临床微生物实验室承担了很多鉴别诊断检测。新型冠状病毒肺炎确诊患者的临床标本中可能存在高载量的 2019 新型冠状病毒，微生物标本不可灭活且类型多样，手工操作多，产生气溶胶的可能性大。尽管检验人员按《医疗机构内新型冠状病毒感染预防与控制技术指南（第一版）》[1]要求进行三级生物安全实验室的个人防护，但临床微生物检验工作生物安全风险仍然难以避免。因此，临床微生物实验室面临工作量和生物安全风险增加的双重挑战。本文介绍了 Kiestra（美国 BD 公司）和 WASPLab（法国生物梅里埃股份有限公司）这 2 种全自动微生物流水线，两者均具有多个模块，并由轨道连接，可实现自动接种、培养、开盖、拍照、判读，比较了临床微生物传统检测流程和全自动微生物流水线的微生物前处理、培养、鉴定及药敏分析，对病原微生物传统手工检测方法存在的生物安全风险与全自动微生物流水线的生物安全功能进行探讨，对全自动微生物流水线在重大公共卫生突发事件中的生物安全保障作用进行阐述，旨在为未来全自动微生物流水线的推广提供一定依据。
1 标本前处理
1.1 传统前处理流程
临床微生物传统前处理流程复杂，主要表现在标本类型、涂片、培养、药敏方式多样。微生物标本类型常包括深部呼吸道标本、血液、尿液、粪便、脑脊液、各类无菌体液、导管标本、病理组织等。标本送至实验室，技术人员根据标本来源及医嘱目的进行手工涂片染色和选择培养。病原微生物分离方法多种，如平板划线、斜面接种、液体接种、穿刺接种、涂布接种等；其中划线方法又分为分区划线、连续划线、棋盘划线等。标本前处理过程繁杂，容易产生大量的气溶胶，虽处理过程在Ⅱ级生物安全柜中开盖操作，但面对 2019 新型冠状病毒感染的重症或危重症患者的微生物培养标本，发生皮肤暴露、手套破损、操作台面污染等风险暴露时若处置不当，则会间接增加实验室生物安全风险[2-3]。2019 新型冠状病毒的主要传播途径是呼吸道飞沫及密切接触，且该病毒对紫外线、热（56℃ 持续 30 min）敏感，乙醚、75% 乙醇、含氯消毒剂、过氧乙酸、氯仿等脂溶剂均可将其灭活[4]。目前，2019 新型冠状病毒在呼吸道标本、尿液和粪便标本都可分离到，应注意气溶胶和接触传播[5-6]。在允许的情况下，部分检验项目可对标本灭活再进行检测，如进行 2019 新型冠状病毒核酸检测时，常在 56℃ 下对标本灭活 45 min，再进行提取及扩增实验以降低生物安全风险[7]。然而，临床微生物检验以检测病原体为目的，标本不能灭活，而需在保证标本中生命活性的前提下进行操作，生物安全风险大大增加。
1.2 全自动微生物流水线的前处理
新型冠状病毒肺炎疫情下，如何运用全自动微生物流水线有效避免生物安全暴露是值得讨论的问题。全自动流水线前处理系统主要有以下几个特点：① 利用机械臂，自动打开患者标本容器，进行挑取和涂布，避免人工操作导致气溶胶产生；② 利用磁力驱动磁珠滚动或模拟接种环，在培养基平面划线，划线过程为全封闭（磁珠）或全开盖（接种环）；③ 多种划线模式，可根据不同标本类型进行选择，如呼吸道标本选择分区划线，尿液选择连续划线等；④ 自带Ⅱ级生物安全柜或高效过滤器，保证生物安全性（表 1）。检测 2019 新型冠状病毒感染或疑似感染患者的呼吸道、尿液、粪便标本时，使用自动化前处理系统可以减少人员操作，减少气溶胶产生，降低生物安全风险，降低操作人员的感染风险，最大限度保护操作人员。
表1
全自动微生物流水线前处理系统的生物安全性
2 微生物培养过程
2.1 传统培养过程
完成标本接种分离后，需选择不同营养条件、温度湿度、气体环境对病原微生物进行培养。常用培养温度为 37℃，湿度 95%。培养箱温湿度适中，利于病原体生长，也利于病毒存活。目前对 2019 新型冠状病毒理化特性的认识基于严重急性呼吸综合征冠状病毒和中东呼吸综合征冠状病毒的研究[1]，严重急性呼吸综合征病毒在 37℃ 下可存活 4 d，在室温 24℃ 下病毒在尿液中至少存活 10 d，在腹泻患者的痰液和粪便里可存活 5 d 以上，在血液中可存活约 15 d，在塑料、玻璃、金属、布料、复印纸等多种物体表面均可存活 2～3 d[8]。新型冠状病毒肺炎疫情期间，微生物培养过程的生物安全风险性较以往提高，经过 24 h 培养，对病原体进行选择鉴定时需进行开盖观察菌落形态、革兰染色、分纯菌落、细菌生化试验等操作。培养皿中湿度很高，开盖时大量气溶胶溢出，易造成污染。
2.2 全自动微生物流水线的培养过程
流水线前处理系统通过轨道将完成接种的平板传送到智能培养箱中培养，此过程有效缩短为 6～10 h[9-10]，降低了传统微生物前处理分离后通过人工传送至专用培养箱孵育过程中开箱时气溶胶感染风险。传送智能培养箱除提供传统培养箱相同功能外，还具有轨道传递、自动拍照和自动卸载等功能（表 2）。智能培养箱的动态数字成像系统可实时监测细菌生长情况，并可根据实验室需求自定义拍摄时间和间隔。通过专用的培养基数字影像分析工作站即刻观察菌落情况，避免了人工开盖观察的生物安全风险，减少了工作量。微生物自动化流水线的应用促使实验室生物安全管理及实验室医疗废物管理频率减少 10%～20%[11]。
表2
全自动微生物流水线智能培养箱基本参数
3 微生物鉴定及药敏分析
3.1 传统微生物鉴定及药敏分析
传统微生物鉴定及药敏分析过程中手工程序较多，主要包括取纯菌落配制菌悬液、菌液转移、手工药敏操作及判读等各环节。其中配置 0.5 麦氏浊度单位菌悬液为开盖、开管操作，菌液转移、涂布平板以及药敏分析往往也为半开放式操作。因病原菌种类不同，0.5 麦氏浊度单位对应细菌数量不同，但通常认为相当于 1.5×108麦氏浊度单位/mL。因此，鉴定及药敏分析操作中病原体浓度高，产生带有感染因子气溶胶的可能性大。鉴定及药敏分析过程需要规范操作，防止意外事件发生。新型冠状病毒肺炎疫情暴发后，微生物鉴定及药敏分析流程的生物安全问题更加值得重视。
3.2 全自动微生物流水线的鉴定及药敏分析
与全自动微生物流水线相连的自动化鉴定及药敏分析模块中的鉴定部分在国外已经上市（图 1）。该模块可从智能培养箱调取平板，通过轨道传送到制备模块和鉴定及药敏分析模块。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱具有快速、灵敏、准确、高通量及易自动化等特点，是微生物快速鉴定技术中里程碑式的变革[12-13]。目前，独立运行的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱工作站在我国各级医院已有不少应用。全自动流水线与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱自动化接口已实现，可进行鉴定及药敏分析工作，全/半封闭进行病原菌挑取、点靶、菌悬液制备、转移、条码识别、鉴定及药敏结果读取等，大大降低了操作人员被感染的概率。
图1
全自动微生物流水线模块示意图
本文展示的全自动微生物流水线模块仅模拟全自动流水线模块布局，与上市产品略有不同。1：平板自动分选；2：平板条码标签；3：接种与划线模块；4：高清屏幕工作站；5：智能培养箱；6：平板堆叠模块；7：质谱靶板制备模块（未上市）；8：质谱；9：药敏制备模块（未上市）；10：自动鉴定药敏仪（国外上市）；11：轨道系统
4 小结与展望
此次新型冠状病毒肺炎疫情下，实验室人员进行临床标本检测时应规范防护，防止过度与不足[14]。保障实验室生物安全是战胜新型冠状病毒肺炎疫情的关键，需要深入排查风险点，制定针对不同风险级别的安全制度[15]。全自动微生物流水线有效降低了微生物前处理到鉴定及药敏分析各个环节的生物安全风险，为实验室生物安全提供了更多保障。需要强调的是，所有感染或疑似感染 2019 新型冠状病毒的标本在转运、检测、处理和销毁时，均应严格按照《新型冠状病毒实验室生物安全指南》执行[16]。全自动微生物流水线的应用，带来了新的生物安全风险管理模式，但流水线并不是完美的方案，在其应用过程中还会出现各种困难和问题，如全自动微生物流水线轨道系统是否可在密闭环境中完成标本传输；智能培养箱成像系统在开盖拍照时局部产生的气溶胶该如何生物安全保障，可否增加移动式设备（紫外灯、空气消毒器）进行间断性消毒；成像系统与培养箱相通，开盖拍照后产生的气溶胶是否进入孵箱，是否具备灭活系统进行孵箱环境处理等，都需要不断思考与总结。临床微生物实验室应加强生物安全管理，发挥和完善全自动微生物流水线在面对重大公共卫生突发事件中的生物安全功能。
此次新型冠状病毒肺炎疫情暴发后，除病毒检测工作外，临床微生物实验室承担了很多鉴别诊断检测。新型冠状病毒肺炎确诊患者的临床标本中可能存在高载量的 2019 新型冠状病毒，微生物标本不可灭活且类型多样，手工操作多，产生气溶胶的可能性大。尽管检验人员按《医疗机构内新型冠状病毒感染预防与控制技术指南（第一版）》[1]要求进行三级生物安全实验室的个人防护，但临床微生物检验工作生物安全风险仍然难以避免。因此，临床微生物实验室面临工作量和生物安全风险增加的双重挑战。本文介绍了 Kiestra（美国 BD 公司）和 WASPLab（法国生物梅里埃股份有限公司）这 2 种全自动微生物流水线，两者均具有多个模块，并由轨道连接，可实现自动接种、培养、开盖、拍照、判读，比较了临床微生物传统检测流程和全自动微生物流水线的微生物前处理、培养、鉴定及药敏分析，对病原微生物传统手工检测方法存在的生物安全风险与全自动微生物流水线的生物安全功能进行探讨，对全自动微生物流水线在重大公共卫生突发事件中的生物安全保障作用进行阐述，旨在为未来全自动微生物流水线的推广提供一定依据。
1 标本前处理
1.1 传统前处理流程
临床微生物传统前处理流程复杂，主要表现在标本类型、涂片、培养、药敏方式多样。微生物标本类型常包括深部呼吸道标本、血液、尿液、粪便、脑脊液、各类无菌体液、导管标本、病理组织等。标本送至实验室，技术人员根据标本来源及医嘱目的进行手工涂片染色和选择培养。病原微生物分离方法多种，如平板划线、斜面接种、液体接种、穿刺接种、涂布接种等；其中划线方法又分为分区划线、连续划线、棋盘划线等。标本前处理过程繁杂，容易产生大量的气溶胶，虽处理过程在Ⅱ级生物安全柜中开盖操作，但面对 2019 新型冠状病毒感染的重症或危重症患者的微生物培养标本，发生皮肤暴露、手套破损、操作台面污染等风险暴露时若处置不当，则会间接增加实验室生物安全风险[2-3]。2019 新型冠状病毒的主要传播途径是呼吸道飞沫及密切接触，且该病毒对紫外线、热（56℃ 持续 30 min）敏感，乙醚、75% 乙醇、含氯消毒剂、过氧乙酸、氯仿等脂溶剂均可将其灭活[4]。目前，2019 新型冠状病毒在呼吸道标本、尿液和粪便标本都可分离到，应注意气溶胶和接触传播[5-6]。在允许的情况下，部分检验项目可对标本灭活再进行检测，如进行 2019 新型冠状病毒核酸检测时，常在 56℃ 下对标本灭活 45 min，再进行提取及扩增实验以降低生物安全风险[7]。然而，临床微生物检验以检测病原体为目的，标本不能灭活，而需在保证标本中生命活性的前提下进行操作，生物安全风险大大增加。
1.2 全自动微生物流水线的前处理
新型冠状病毒肺炎疫情下，如何运用全自动微生物流水线有效避免生物安全暴露是值得讨论的问题。全自动流水线前处理系统主要有以下几个特点：① 利用机械臂，自动打开患者标本容器，进行挑取和涂布，避免人工操作导致气溶胶产生；② 利用磁力驱动磁珠滚动或模拟接种环，在培养基平面划线，划线过程为全封闭（磁珠）或全开盖（接种环）；③ 多种划线模式，可根据不同标本类型进行选择，如呼吸道标本选择分区划线，尿液选择连续划线等；④ 自带Ⅱ级生物安全柜或高效过滤器，保证生物安全性（表 1）。检测 2019 新型冠状病毒感染或疑似感染患者的呼吸道、尿液、粪便标本时，使用自动化前处理系统可以减少人员操作，减少气溶胶产生，降低生物安全风险，降低操作人员的感染风险，最大限度保护操作人员。
表1
全自动微生物流水线前处理系统的生物安全性
2 微生物培养过程
2.1 传统培养过程
完成标本接种分离后，需选择不同营养条件、温度湿度、气体环境对病原微生物进行培养。常用培养温度为 37℃，湿度 95%。培养箱温湿度适中，利于病原体生长，也利于病毒存活。目前对 2019 新型冠状病毒理化特性的认识基于严重急性呼吸综合征冠状病毒和中东呼吸综合征冠状病毒的研究[1]，严重急性呼吸综合征病毒在 37℃ 下可存活 4 d，在室温 24℃ 下病毒在尿液中至少存活 10 d，在腹泻患者的痰液和粪便里可存活 5 d 以上，在血液中可存活约 15 d，在塑料、玻璃、金属、布料、复印纸等多种物体表面均可存活 2～3 d[8]。新型冠状病毒肺炎疫情期间，微生物培养过程的生物安全风险性较以往提高，经过 24 h 培养，对病原体进行选择鉴定时需进行开盖观察菌落形态、革兰染色、分纯菌落、细菌生化试验等操作。培养皿中湿度很高，开盖时大量气溶胶溢出，易造成污染。
2.2 全自动微生物流水线的培养过程
流水线前处理系统通过轨道将完成接种的平板传送到智能培养箱中培养，此过程有效缩短为 6～10 h[9-10]，降低了传统微生物前处理分离后通过人工传送至专用培养箱孵育过程中开箱时气溶胶感染风险。传送智能培养箱除提供传统培养箱相同功能外，还具有轨道传递、自动拍照和自动卸载等功能（表 2）。智能培养箱的动态数字成像系统可实时监测细菌生长情况，并可根据实验室需求自定义拍摄时间和间隔。通过专用的培养基数字影像分析工作站即刻观察菌落情况，避免了人工开盖观察的生物安全风险，减少了工作量。微生物自动化流水线的应用促使实验室生物安全管理及实验室医疗废物管理频率减少 10%～20%[11]。
表2
全自动微生物流水线智能培养箱基本参数
3 微生物鉴定及药敏分析
3.1 传统微生物鉴定及药敏分析
传统微生物鉴定及药敏分析过程中手工程序较多，主要包括取纯菌落配制菌悬液、菌液转移、手工药敏操作及判读等各环节。其中配置 0.5 麦氏浊度单位菌悬液为开盖、开管操作，菌液转移、涂布平板以及药敏分析往往也为半开放式操作。因病原菌种类不同，0.5 麦氏浊度单位对应细菌数量不同，但通常认为相当于 1.5×108麦氏浊度单位/mL。因此，鉴定及药敏分析操作中病原体浓度高，产生带有感染因子气溶胶的可能性大。鉴定及药敏分析过程需要规范操作，防止意外事件发生。新型冠状病毒肺炎疫情暴发后，微生物鉴定及药敏分析流程的生物安全问题更加值得重视。
3.2 全自动微生物流水线的鉴定及药敏分析
与全自动微生物流水线相连的自动化鉴定及药敏分析模块中的鉴定部分在国外已经上市（图 1）。该模块可从智能培养箱调取平板，通过轨道传送到制备模块和鉴定及药敏分析模块。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱具有快速、灵敏、准确、高通量及易自动化等特点，是微生物快速鉴定技术中里程碑式的变革[12-13]。目前，独立运行的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱工作站在我国各级医院已有不少应用。全自动流水线与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱自动化接口已实现，可进行鉴定及药敏分析工作，全/半封闭进行病原菌挑取、点靶、菌悬液制备、转移、条码识别、鉴定及药敏结果读取等，大大降低了操作人员被感染的概率。
图1
全自动微生物流水线模块示意图
本文展示的全自动微生物流水线模块仅模拟全自动流水线模块布局，与上市产品略有不同。1：平板自动分选；2：平板条码标签；3：接种与划线模块；4：高清屏幕工作站；5：智能培养箱；6：平板堆叠模块；7：质谱靶板制备模块（未上市）；8：质谱；9：药敏制备模块（未上市）；10：自动鉴定药敏仪（国外上市）；11：轨道系统
4 小结与展望
此次新型冠状病毒肺炎疫情下，实验室人员进行临床标本检测时应规范防护，防止过度与不足[14]。保障实验室生物安全是战胜新型冠状病毒肺炎疫情的关键，需要深入排查风险点，制定针对不同风险级别的安全制度[15]。全自动微生物流水线有效降低了微生物前处理到鉴定及药敏分析各个环节的生物安全风险，为实验室生物安全提供了更多保障。需要强调的是，所有感染或疑似感染 2019 新型冠状病毒的标本在转运、检测、处理和销毁时，均应严格按照《新型冠状病毒实验室生物安全指南》执行[16]。全自动微生物流水线的应用，带来了新的生物安全风险管理模式，但流水线并不是完美的方案，在其应用过程中还会出现各种困难和问题，如全自动微生物流水线轨道系统是否可在密闭环境中完成标本传输；智能培养箱成像系统在开盖拍照时局部产生的气溶胶该如何生物安全保障，可否增加移动式设备（紫外灯、空气消毒器）进行间断性消毒；成像系统与培养箱相通，开盖拍照后产生的气溶胶是否进入孵箱，是否具备灭活系统进行孵箱环境处理等，都需要不断思考与总结。临床微生物实验室应加强生物安全管理，发挥和完善全自动微生物流水线在面对重大公共卫生突发事件中的生物安全功能。
